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基孔肯雅熱IgG抗體檢測試劑盒

【產(chǎn)品名稱】

通用名稱：基孔肯雅熱IgG檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫法）

英文名稱：Chikungunya IgG micro-capture ELISA

【產(chǎn)品規(guī)格】

96T

【預(yù)期用途】

試劑盒可用于人血清和血漿（檸檬酸鹽）中基孔肯雅熱IgG抗體的定性檢測。

【前言簡介】

基孔肯雅熱病毒是一種屬于披膜病毒科甲病毒屬的節(jié)肢動物媒介病毒。披膜病毒科甲病毒屬（α-病毒屬）至少有24種不同的種屬。它們是一類脂質(zhì)圍繞的病毒體，直徑約為50-60nm。

α-病毒感染初是由感染的蚊子叮咬引起的，感染后，病毒借機進入皮下和皮膚組織。1至12天，演變?yōu)榛卓涎艧帷?/span>

基孔肯雅熱是一種急性病毒感染，以快速病變?yōu)樘卣鳎腥竞蠼】禒顟B(tài)迅速惡化產(chǎn)生疾病，包括嚴(yán)重的關(guān)節(jié)痛和發(fā)燒。

體溫會突然上升，可高達40℃，并伴有寒戰(zhàn)。幾天后，發(fā)燒癥狀減弱，繼而復(fù)發(fā)，這樣周而復(fù)始的類似鞍狀峰狀曲線 體溫。關(guān)節(jié)痛主要表現(xiàn)在多關(guān)節(jié)，主要累及小關(guān)節(jié)區(qū)域的嚴(yán)重受損，隨運動增加，疼痛加劇?；颊咄ǔ?yīng)避免移動。關(guān)節(jié)會腫脹，但無明顯關(guān)節(jié)液體積聚。這類癥狀持續(xù)1周至數(shù)月并伴隨有肌痛。病發(fā)一天會出現(xiàn)皮疹，但也有延遲出現(xiàn)的，然后皮疹漫延至臉部，頸部，演變?yōu)榘哒?、丘疹或紫?,疹間皮膚多為正常 ,伴有瘙癢感，繼而軀干、四肢的伸展側(cè)、手掌和足底出現(xiàn)皮疹。也能觀察到瘀斑皮膚受損。頭痛，畏光，有明顯咽炎，惡心，嘔吐的咽喉痛也是病發(fā)可能出現(xiàn)的癥狀。很多情況下，關(guān)節(jié)痛和多發(fā)性關(guān)節(jié)炎會持續(xù)數(shù)月仍至數(shù)年，常伴有關(guān)節(jié)受損，更有罕見者，出現(xiàn)包括腦炎，高致命性腦膜腦炎的后遺癥。

這類病毒在非洲和亞洲為高發(fā)區(qū)。20%至90%熱帶和亞熱區(qū)人群發(fā)現(xiàn)有感染的血清學(xué)證據(jù)。由于伊蚊在北非和南美急劇橫行，這些地帶的人群對病毒都有易感性，因此造成爆發(fā)疫情的可能性。中歐人群的感染主要是因為一些曾到過熱帶和亞熱帶的旅行者攜帶基孔肯雅熱病毒而傳染的。

病毒感染可由以下方法鑒別

• 血清學(xué)： 免疫熒光、酶免法檢測相應(yīng)的抗體

【檢測原理】

試劑盒采用酶聯(lián)免疫法。微孔中預(yù)包被有抗人IgG，用于結(jié)合樣品中相應(yīng)的抗體。洗板后，去除非結(jié)合的樣品。再加入基孔肯雅熱抗原液，再次洗板后，再加入生物素化的基孔肯雅熱抗體。加入鏈霉親和素標(biāo)記結(jié)合物（酶聯(lián)物），與固相的特異性的基孔肯雅熱復(fù)合物結(jié)合。加入TMB底物液后，微孔中顯藍色。顯色的強度與病人樣品中基孔肯雅熱IgG抗體的量成正比。加入終止液終止酶反應(yīng)，形成黃色終點產(chǎn)物。后在酶標(biāo)儀處450 nm讀數(shù)。

【試劑盒組成成分】

微孔板            12×8

包被有抗人IgG

樣品稀釋液        1×100 mL

即用型、pH7.2±0.2、黃色、白蓋

洗滌液            1×50ml

20倍濃縮、pH7.2±0.2、白蓋

基孔肯雅熱抗原液  6瓶

凍干品、紅蓋

基孔肯雅熱抗體液  1×6ml

含生物素化基孔肯雅熱抗體、即用型、藍色、白蓋

鏈霉親和素酶聯(lián)物  1×6ml

含鏈霉親和素標(biāo)記的HRP、即用型、紅色、黑蓋

終止液            1×15ml

即用型、含硫酸、濃度0.2mol/L、紅蓋

底物液            1×15ml

即用型、黃蓋

陽性質(zhì)控          1×1.5ml

即用型、黃色、紅蓋

臨界質(zhì)控          1×2ml

即用型、黃色、綠蓋

陰性質(zhì)控          1×1.5ml

即用型、黃色、藍蓋

封板紙

支架

所需材料（未提供）

·酶標(biāo)儀（450/620 nm）

·恒溫箱（37 ℃）

·洗瓶或自動洗板機

·移液管（規(guī)格10和1000 µL）

·震蕩器

·去離子水或蒸餾水

·一次性試管

·計時器

【儲存條件】

試劑盒存于2~8℃，能穩(wěn)定保存至有效期，有效期見標(biāo)簽 。

【樣品要求】

試驗采用人血清或血漿（檸檬酸鹽）。收集的樣品在2~8℃可保存5天。更長時間，分成小份，凍存于（-20~-70℃）。 凍存樣品，試驗前應(yīng)*解凍。避免反復(fù)凍融。

不建議使用熱滅活樣品

樣品稀釋

試驗前樣品應(yīng)稀釋：1個單位的樣品+100個單位的樣品稀釋液，如10µL樣品+1mL樣品稀釋液，在試管中旋渦搖勻。

【檢測方法】

試劑準(zhǔn)備

試驗前，將所有試劑，樣品，質(zhì)控品平衡至室溫(20~25℃)

基孔肯雅熱抗原：

每瓶加入1mL稀釋洗滌液溶解，緩慢加入，室溫下靜置溫育15min，制成即用型抗原液。此抗原液在2~8 ℃可穩(wěn)定保存1天。

洗滌液：

1個單位的濃縮洗滌液+19個單位的雙蒸水。

如：10mL濃縮洗滌液+190 mL雙蒸水。稀釋洗滌液在室溫下能穩(wěn)定保存5天。開瓶后，濃縮的洗滌液在2~8℃可穩(wěn)定保存至有效期.

檢測步驟

試驗前，仔細(xì)閱讀說明書。嚴(yán)格執(zhí)行說明書要求才能得到優(yōu)良結(jié)果。如試驗使用自動洗板機，建議每孔350µL，洗板5次（如手工洗，則每孔300µL，洗板3次）。試驗前，確定好樣品，質(zhì)控品的加樣布局方案。取所需板條置于板架上。

至少設(shè)

1孔（如A1）         空白對照

1孔 (如B1)          陰性質(zhì)控

2孔 (如C1+D1）      臨界質(zhì)控

1孔（如E1）         陽性質(zhì)控

如覺得有必要，建議樣品和質(zhì)控品都作雙份檢測。

試驗應(yīng)按同樣的加樣順序加取試劑，避免不同的時間間隔造成誤差。

使用新的一次性加樣槍頭，加各質(zhì)控品，樣品

調(diào)節(jié)恒溫箱為37±1℃

• 加50µL質(zhì)控品和稀釋樣品至相應(yīng)各孔中，設(shè)A1作為空白對照
• 封板紙蓋板
• 37 ± 1 ℃溫育1小時±5分鐘
• 溫育后，移除封板紙，倒出微孔內(nèi)液體，每孔用300µL稀釋洗滌液，洗板3次，避免洗滌液相互溢濺至其它微孔。每次洗板時，浸泡時間應(yīng)大于5秒。后，在吸水紙上拍干，去除殘留液滴。

注意：洗滌步驟很關(guān)鍵。不充分的洗板，會導(dǎo)致不精確或錯誤上升的吸光度值。

• 除空白對照孔（A1）外，加50µL基孔肯雅熱液抗原液至各孔，蓋板
• 室溫下溫育30分鐘
• 重復(fù)步驟4
• 除空白對照孔（A1）外，加50µL 基孔肯雅熱液抗體液至各孔，蓋板
• 室溫下溫育30分鐘
• 重復(fù)步驟4
• 除空白對照孔（A1）外，各加50µL鏈酶親和素酶聯(lián)物至各孔，蓋板
• 室溫下溫育30分鐘
• 重復(fù)步驟4
• 加100 µL TMB底物液至各孔中
• 黑暗處，精確溫育15分鐘
• 按加TMB底物液的順序和速度，加100 µL終止液至各孔中。

藍色溶液在孵育過程中變?yōu)辄S色。

注意：強陽性樣品會導(dǎo)致色原產(chǎn)生沉淀，沉淀的產(chǎn)生會對讀數(shù)產(chǎn)生影響。所以先用陰性基質(zhì)進行預(yù)稀釋，建議1：1的比例稀釋，然后，再1個單位的預(yù)稀釋樣品+100個單位的樣品稀釋液。終結(jié)果（以U計算）乘以預(yù)稀釋因子2即可

• 加入終止液后，30分鐘內(nèi)，在酶標(biāo)儀450/620 nm處讀數(shù)

【結(jié)果計算】

用A1空白對照孔對酶標(biāo)儀進行調(diào)零

如遇技術(shù)問題，酶標(biāo)儀不能調(diào)零。 所測樣品的吸光度值減去空白對照的讀數(shù)值，

即可得到較可靠的讀數(shù)。

在酶標(biāo)儀處450 nm處測讀所有質(zhì)控品和樣品的吸光度值。620 nm作為參考波長。

如進行雙孔檢測，計算吸光度均值。

實驗有效性標(biāo)準(zhǔn)

如試驗有效，必須滿足以下要求

·空白對照（A1）：       吸光度值<  0.100

·陰性質(zhì)控（B1）：       吸光度值<  臨界讀數(shù)

·臨界質(zhì)控（C1+D1）     吸光度值   0.150~1.300

·陽性質(zhì)控（E1）        吸光度值>  臨界讀數(shù)

如上述標(biāo)準(zhǔn)沒滿足，試驗視為無效，試驗應(yīng)重測。

結(jié)果計算

臨界讀數(shù)是雙孔臨界質(zhì)控的吸光度均值

示范： 臨界吸光度值0.39 +臨界吸光度值0.37＝0.76 / 2 = 0.38

即吸光度值＝0.38

結(jié)果分析說明

樣品吸光度值高于臨界讀數(shù)的10 %視為陽性結(jié)果。

樣品吸光度值在臨界讀數(shù)的±10 %范圍內(nèi)視為灰色可疑區(qū)

建議2－4周后，重新取新鮮的樣品進行試驗。如試驗結(jié)果仍為灰色可疑區(qū)，視

為陰性結(jié)果

樣品吸光度值低于臨界讀數(shù)的10%視為陰性結(jié)果

結(jié)果以U表示

病人吸光度均值×10        

--―――――――  ＝ [Units=U]

臨界指數(shù)

示范： 1.216×10   

       -------------   =32 U（Units）

         0.38

臨界：    10 U

灰區(qū)：    9-11 U

陰性：    <9 U

陽性：    >11 U

【注意事項】

• 試劑僅供體外診斷和專業(yè)人士使用。
• 在檢測開始之前，仔細(xì)和完整的閱讀說明書，使用試劑盒提供的說明書的有效版本，確保所有的程序都清楚。
• 如果試劑盒有破壞的請與IBL公司聯(lián)系或是提交您的投訴單，但自您拿到試劑盒后遲不超過一個星期。在檢測時請不要使用受損的試劑，并妥善保管好以備投訴時使用。
• 按照批號和有效期，不要混合使用不同批號的試劑，也不要使用過期的試劑。
• 遵守實驗室優(yōu)化管理規(guī)則和安全指南，穿實驗服，帶橡皮手套，有必要時請戴護目鏡。
• 這種試劑盒中含有會傷害眼睛和皮膚的有害試劑，請閱讀材料來源和標(biāo)簽獲取詳細(xì)信息。產(chǎn)品的材料安全數(shù)據(jù)能夠從IBL公司主頁上載可直接咨詢IBL公司獲取。
• 根據(jù)國家生物有害物質(zhì)及安全條例，所有化學(xué)藥品和準(zhǔn)備或使用過的試劑都應(yīng)當(dāng)做有害物質(zhì)進行處理。
• 避免接觸終止液，以免刺激或灼燒皮膚。
• 試劑盒中部分試劑含有疊*化鈉作為防腐劑，一旦與皮膚或者眼睛發(fā)生接觸，立即用大量清水沖洗. *氮化鈉可能會與鉛和銅的管道發(fā)生反應(yīng)，形成爆炸性的金屬疊氮化物。當(dāng)處理試劑時，使用大量水沖洗以防止疊氮化物的形成。
• 試劑盒中的所有試劑包括檢測過的人血清/血漿對HIV/II，HbsAg和HCV都表現(xiàn)為陰性，但是試劑中會出現(xiàn)此類病毒（HIV/II，HbsAg和HCV）或其他具有感染性的病原體的可能性都不能*被排除。因此，所有的試劑在使用和處理的過程中都應(yīng)當(dāng)作潛在生物有害物質(zhì)進行處理。

操作注意事項

1. 樣品的不合理處理及實驗操作的任何改動都將影響實驗的結(jié)果。取樣體積、溫育時間、預(yù)處理步驟都必須嚴(yán)格按說明進行。只能使用標(biāo)準(zhǔn)取樣器和標(biāo)準(zhǔn)設(shè)備。

2. 一旦實驗開始，所有的步驟都必須完整的進行下去，不允許中斷。在使用前，將所有試劑和樣品都平衡至室溫（18-25℃），輕輕搖動液體試劑和樣品，試劑混合過程中要避免氣泡。

3. 避免污染試劑、取樣器、微孔/試管。加試劑和樣本時，請使用新的取樣吸頭。不要交換瓶蓋。蓋好不使用的試劑。不要重復(fù)使用微孔/試管或者試劑。

4. 用定標(biāo)儀對反應(yīng)板進行校準(zhǔn)。

5. 溫育時間會影響實驗結(jié)果。微孔加樣的順序和時間都必須*。建議使用8孔微量取樣器給微孔加樣。

6. 微量板的清洗非常重要，微孔清洗不好將會形成錯誤的實驗結(jié)果。建議使用多孔取樣器或自動微孔清洗設(shè)備進行清洗。每次溫育間隔期間要避免微孔干燥。加洗滌液和吸液時要避免碰到包被孔。清洗和加試劑時都應(yīng)特別小心。清洗時，在微孔中精確的加入洗滌液緩沖液，同時確保微孔中無殘渣。

7. 濕度會影響包被板，所以在未到達室溫時請勿打開包裝，未使用的包被板要重新密封于裝有干燥劑的包裝袋中。             

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